CRISPR'a geçin, Retronlar geliyor

Araştırmacılar, eşzamanlı olarak milyonlarca mutasyon oluşturabilen Retron Library Recombineering (RLR) adlı yeni bir gen düzenleme aracı ve tüm havuzun aynı anda taranabilmesi için mutant bakteri hücrelerini 'barkodlar' oluşturdu.

CRISPR'a geçin, Retronlar geliyor
Dünya 12 Mayıs 2021 Çarşamba 12:05

Araştırmacılar, eşzamanlı olarak milyonlarca mutasyon oluşturabilen Retron Library Recombineering (RLR) adlı yeni bir gen düzenleme aracı ve tüm havuzun aynı anda taranabilmesi için mutant bakteri hücrelerini 'barkodlar' oluşturdu. CRISPR'nin toksik olduğu veya uygulanabilir olmadığı bağlamlarda kullanılabilir ve daha iyi düzenleme oranları sağlar.

CRISPR-Cas9 gen düzenleme sistemi, sentetik biyolojide yeniliğin poster çocuğu haline gelirken, bazı büyük sınırlamaları vardır. CRISPR-Cas9, belirli DNA parçalarını bulmak ve kesmek için programlanabilir, ancak istenen mutasyonları oluşturmak için DNA'yı düzenlemek, hücrenin kırılmayı onarmak için yeni bir DNA parçası kullanması için kandırılmasını gerektirir. Bu yemle ve değiştirmeyi düzenlemek karmaşık olabilir ve hatta hücreler için toksik olabilir çünkü Cas9 genellikle istenmeyen, hedef dışı siteleri de keser.

Bunun yerine, rekombinasyon adı verilen alternatif gen düzenleme teknikleri, bir hücre genomunu kopyalarken, DNA'yı kırmadan verimli bir şekilde genetik mutasyonlar oluştururken alternatif bir DNA parçası ekleyerek bu yem ve değiştirme işlemini gerçekleştirir. Bu yöntemler, araştırmacıların incelemesi için karmaşık mutasyon havuzları oluşturmak için aynı anda birçok hücrede kullanılabilecek kadar basittir. Bununla birlikte, bu mutasyonların etkilerinin ne olduğunu anlamak, her mutantın izole edilmesini, dizilenmesini ve karakterize edilmesini gerektirir: zaman alıcı ve pratik olmayan bir görev.

Harvard Üniversitesi ve Harvard Tıp Fakültesi'ndeki (HMS) Wyss Biyolojik Esinlenen Mühendislik Enstitüsü'ndeki araştırmacılar, bu görevi kolaylaştıran Retron Library Recombineering (RLR) adlı yeni bir gen düzenleme aracı oluşturdu. RLR, aynı anda milyonlarca mutasyona kadar üretir ve mutant hücreleri "barkodlar", böylece tüm havuz tek seferde taranabilir, bu da büyük miktarda verinin kolayca oluşturulmasını ve analiz edilmesini sağlar. Bakteriyel hücrelerde elde edilen başarı, PNAS'ta yakın zamanda yayınlanan bir makalede anlatılmıştır .

"RLR, CRISPR ile yapılması imkansız bir şeyi yapmamızı sağladı: rastgele bir bakteri genomunu parçaladık, bu genetik parçaları yerinde tek iplikli DNA'ya dönüştürdük ve aynı anda milyonlarca diziyi taramak için kullandık" dedi. Max Schubert, Ph.D., Wyss Core Öğretim Üyesi George Church, Ph.D. "RLR, CRISPR ile sıklıkla gözlemlenen toksisiteyi ortadan kaldıran ve araştırmacıların genom düzeyinde mutasyonları keşfetme becerisini geliştiren, yüksek oranda çoğullamalı deneyler için kullanılabilen daha basit, daha esnek bir gen düzenleme aracıdır."

Retronlar: muammadan mühendislik aracına

Retronlar, tek sarmallı DNA (ssDNA) parçalarını üretmek için ters transkripsiyona giren bakteriyel DNA segmentleridir. Retronların varlığı on yıllardır biliniyor, ancak 1980'lerden Haziran 2020'ye kadar ürettikleri ssDNA'nın işlevi, sonunda retron ssDNA'nın bir virüsün hücreyi enfekte edip etmediğini tespit ederek bakteriyel bağışıklığın bir parçasını oluşturduğunu anladığında flummoxed bilim adamları ürettikleri ssDNA'nın işlevi. sistemi.

Retronlar başlangıçta bakterilerin gizemli bir tuhaflığı olarak görülürken, araştırmacılar son birkaç yılda onlarla daha fazla ilgilenmeye başladılar çünkü CRISPR gibi bakteriler, mayalar ve hatta insan hücrelerinde hassas ve esnek gen düzenleme için kullanılabilirler.

Schubert, "CRISPR uzun süredir bakterilerin yaptığı tuhaf bir şey olarak görülüyordu ve genom mühendisliği için onu nasıl kullanacağını bulmak dünyayı değiştirdi. Retronlar da bazı önemli ilerlemeler sağlayabilecek başka bir bakteriyel yeniliktir," dedi. Retronlara olan ilgisi, bakterilerde ssDNA üretme kabiliyetleri nedeniyle birkaç yıl önce artmıştı - oligonükleotid rekombinasyonu adı verilen bir gen düzenleme sürecinde kullanım için çekici bir özellik.

Rekombinasyona dayalı gen düzenleme teknikleri, istenen bir mutasyonu içeren ssDNA'nın bir organizmanın DNA'sına entegre edilmesini gerektirir ve bu, iki yoldan biriyle yapılabilir. Çift sarmallı DNA fiziksel olarak kesilebilir (örneğin CRISPR-Cas9 ile), hücrenin onarım işlemi sırasında mutant diziyi kendi genomuna dahil etmesini sağlamak için veya mutant DNA sarmalı ve tek sarmallı bir tavlama proteini (SSAP) SSAP'nin mutant ipliği yavru hücrelerin DNA'sına dahil etmesi için replike olan bir hücreye sokulabilir.

"Retronların bize, onları dışarıdan hücreye zorlamak yerine ve her ikisi de çok ikna edici nitelikler olan doğal DNA'ya zarar vermeden düzenlemek istediğimiz hücrelerde ssDNA üretme yeteneği vermesi gerektiğini düşündük," dedi. - İlk yazar Daniel Goodman, Ph.D., şu anda UCSF'de Jane Coffin Childs Doktora Sonrası Araştırmacı olan Wyss Enstitüsü'nde eski bir Yüksek Lisans Araştırma Görevlisi.

Retronların bir başka cazibesi, dizilerinin kendilerinin, bir bakteri havuzundaki hangi bireylerin her bir retron dizisini aldığını belirleyen "barkodlar" olarak hizmet edebilmesidir ve bu da, kesin olarak oluşturulmuş mutant suşların önemli ölçüde daha hızlı, havuzlanmış ekranlarını mümkün kılar.

Retronlarla verimli yeniden birleştirmeyi başarmak için retronları gerçekten kullanıp kullanamayacaklarını görmek için, Schubert ve meslektaşları ilk olarak retron dizilerinin içine yerleştirilmiş antibiyotik direnç genlerini içeren bakteriyel DNA'nın dairesel plazmidlerini ve ayrıca retron dizisinin içine entegrasyonunu sağlamak için bir SSAP genini yarattılar. bakteri genomu. Bu retron plazmidlerini, genlerin 20 nesil hücre replikasyonundan sonra genomlarına başarıyla entegre edilip edilmediğini görmek için E. coli bakterisine yerleştirdiler. Başlangıçta, retron rekombinasyon sistemini taşıyan E. coli'nin% 0.1'inden daha azı istenen mutasyonu içeriyordu.

Bu hayal kırıklığı yaratan ilk performansı iyileştirmek için ekip, bakteride birkaç genetik ayar yaptı. Birincisi, hücrelerin DNA replikasyon hatalarını düzelten ve bu nedenle bir sonraki nesle aktarılmadan önce istenen mutasyonları "sabitleyen" doğal uyumsuzluk onarım mekanizmasını etkisiz hale getirdiler. Eksonükleazları kodlayan iki bakteri geni de etkisiz hale getirdiler - serbest yüzen ssDNA'yı yok eden enzimler. Bu değişiklikler, retron dizisini içeren bakteri oranını popülasyonun% 90'ından fazlasına önemli ölçüde arttırdı.

Mutantlar için ad etiketleri

Artık retron ssDNA'larının bakterilerinin genomlarına dahil edildiğinden emin olduklarından, ekip retronları bir genetik sıralama "kısayolu" olarak kullanıp kullanamayacaklarını test ederek birçok deneyin bir karışımda yapılmasını sağladı. Her plazmid, bir "isim etiketi" olarak işlev görebilen kendi benzersiz retron sekansına sahip olduğundan, hücrelerin hangi mutasyonu aldığını belirlemek için tüm bakteri genomu yerine çok daha kısa retron'u sıralayabilmeleri gerektiğine karar verdiler.

İlk olarak ekip, RLR'nin E coli'de bilinen antibiyotik direnç mutasyonlarını tespit edip edemeyeceğini test etti. Bu mutasyonları içeren retron dizilerinin, diğer mutasyonlara kıyasla dizileme verilerinde çok daha büyük oranlarda mevcut olduğunu buldular. Ekip ayrıca RLR'nin çok benzer mutasyonlardan kaynaklanan dirençteki küçük farklılıkları ölçmek için yeterince hassas ve kesin olduğunu belirledi. En önemlisi, tek tek mutantları izole etmek ve sıralamak yerine tüm bakteri havuzundan barkodları sıralayarak bu verileri toplamak, süreci önemli ölçüde hızlandırır.

Ardından, araştırmacılar RLR'yi rastgele parçalanmış DNA üzerinde kullanılıp kullanılamayacağını görmek ve aynı anda kaç retron kullanabileceklerini bulmak için bir adım daha ileri götürdüler. Başka bir antibiyotiğe oldukça dirençli bir E. coli suşunun genomunu kestiler ve bu parçaları plazmitlerdeki retron dizilerinde bulunan on milyonlarca genetik diziden oluşan bir kütüphane oluşturmak için kullandılar. "RLR'nin basitliği bu deneyde gerçekten parladı, çünkü şu anda CRISPR ile kullanabileceğimizden çok daha büyük bir kitaplık oluşturmamızı sağladı, burada her bir mutasyonu indüklemek için hem bir kılavuz hem de bir donör DNA dizisi sentezlemeliyiz." dedi Schubert.

Bu kitaplık daha sonra analiz için RLR ile optimize edilmiş E coli suşuna dahil edildi. Araştırmacılar bir kez daha, antibiyotik direnci sağlayan retronların, bakteri havuzu sıralandığında diğerlerine göre zenginleştirildikleri gerçeğiyle kolayca tanımlanabileceğini keşfettiler.

Kıdemli yazar George, "Havuzlanmış, barkodlu mutant kitaplıklarını RLR ile analiz edebilmek, aynı anda milyonlarca deneyin yapılmasını sağlayarak, mutasyonların genom üzerindeki etkilerini ve bu mutasyonların birbirleriyle nasıl etkileşime girebileceğini gözlemlememize olanak tanıdı" dedi. Wyss Enstitüsü'nün Sentetik Biyoloji Odak Alanını yöneten ve aynı zamanda HMS'de Genetik Profesörü olan Church. "Bu çalışma, gelecekteki genetik araştırmalar için birçok heyecan verici olasılık açan diğer genetik sistemlerde RLR'yi kullanmaya yönelik bir yol haritası oluşturmaya yardımcı oluyor."

RLR'yi CRISPR'den ayıran bir başka özellik de, istenen bir mutasyonu başarılı bir şekilde genomlarına entegre eden bakterilerin oranının, bakteriler çoğaldıkça zamanla artarken, CRISPR'nin "tek atış" yönteminin ilk denemede başarılı olma veya başarısız olma eğiliminde olmasıdır. RLR, düzenleme performansını iyileştirmek için CRISPR ile potansiyel olarak birleştirilebilir veya CRISPR'nin toksik olduğu birçok sistemde bir alternatif olarak kullanılabilir.

Düzenleme oranını iyileştirmek ve standartlaştırmak için RLR üzerinde yapılacak daha fazla iş var, ancak bu yeni araçla ilgili heyecan artıyor. RLR'nin basit, aerodinamik yapısı, birden fazla mutasyonun birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğinin incelenmesine ve daha fazla mutasyonel etkiyi tahmin etmek için makine öğreniminin kullanılmasını sağlayabilecek çok sayıda veri noktasının oluşturulmasına olanak sağlayabilir.

Wyss Enstitüsü Kurucu Direktörü Dr. Don Ingber, "Bu yeni sentetik biyoloji aracı, genom mühendisliğini daha da yüksek bir verimlilik düzeyine getiriyor ve bu da şüphesiz yeni, heyecan verici ve beklenmedik yeniliklere yol açacak," dedi. Ingber ayrıca HMS ve Boston Çocuk Hastanesi'nde Judah Folkman Vasküler Biyoloji Profesörü ve Harvard John A. Paulson Mühendislik ve Uygulamalı Bilimler Okulu'nda Biyomühendislik Profesörüdür.

Makalenin diğer yazarları arasında HMS'den Timothy Wannier, Warwick Üniversitesi'nden Divjot Kaur, Massachusetts Institute of Technology'den Fahim Farzadfard ve Timothy Lu ve Gladstone Institute of Data Science and Biotechnology'den Seth Shipman yer alıyor.

Bu araştırma, Amerika Birleşik Devletleri Enerji Bakanlığı (DE-FG02-02ER63445) ve Ulusal Savunma Bilimi ve Mühendisliği Yüksek Lisans Bursu tarafından desteklenmiştir.

KKTC’de Muhaceret Yasa Tasarısı’na onay
Joe Biden İsrail'in kendini savunma hakkına sahip olduğunu söyledi
Fransa Ulusal Meclisi aşı pasaportu yasasını reddetti
ABD'de tüketici enflasyonu nisanda yüzde 4,2 ile beklentileri aştı
Uğur Şahin, "Fikri mülkiyetin korunmasından feragat etmek bir çözüm olmayacağını" savundu
Etiketler: